高效液相色谱仪是一种用于根据大小和表面电荷等特性分离分子的技术仪器。 紫外光谱与高效液相色谱的结合允许在分离后确定分子的浓度。下面我们来简要说明一下什么是高效液相色谱的紫外光谱？


高效液相色谱仪
高效液相色谱仪以前被称为高压液相色谱仪，与低压液相色谱方法不同，因为该方法依赖于重力。通常使用 50 – 350 bar 的压力使液体流动相通过含有固体固定相的柱子。含有吸收剂材料（通常为粒状二氧化硅或聚合物）的色谱柱构成固定相。流动相由加压的液体溶剂混合物组成，通常是水、乙腈和/或甲醇。流动相的选择取决于感兴趣的样品和固定相的组成。样品中的分子与流动相和固定相之间的相互作用程度不同，这决定了它们之间可实现的分离程度。


体积排阻色谱

样品中的分子可以在高效液相色谱仪期间按大小分离。固定相由多孔硅胶珠组成，小分子可以进入，而大分子必须绕过珠子并穿过它们之间的空间。这使得较大的分子比较小的分子洗脱得更快，因为较小的分子会在硅胶珠内停留更长时间。该方法常用于蛋白质、多糖或聚合物的分子量测定，可用于推断蛋白质的三级和四级结构。

离子交换色谱

样品中的分子也可以根据它们对固定相的吸引力进行分离。例如，硅胶固定相在其表面暴露了带有负电荷的氧原子。

样品中带负电荷的分子被阻止与固定相结合，从而更快地洗脱。

一旦非结合分子从色谱柱中通过，就可以改变溶剂条件，将与固定相结合的分子分离并使其洗脱。

该技术常用于水纯化、配体交换色谱和离子交换色谱。

正相色谱

易于溶解在非极性、非水性溶剂（如氯仿）中的样品可以进行正相色谱分析。除了尺寸排阻原理外，还使用极性固定相以允许基于这些特性分离分子。空间因子也会影响分子的保留时间，因此这种方法通常用于分离异构体。例如，具有两个彼此相邻的极性官能团的分子都能够与固定相相互作用。这导致比极性基团位于分子两侧的异构体更长的保留时间，其中官能团无法同时与固定相相互作用。

反相色谱

在反相高效液相色谱仪中，固定相是非极性的，而液体流动相是固定相表面，通常涂有烷基直链，这意味着极性分子由于疏水相互作用而洗脱得更快，而亲水分子则具有更长的保留时间。

反相色谱是最常见的高效液相色谱仪形式，常用于制药行业以进行质量控制。

比尔-朗伯定律

用紫外光照射洗脱的分子可以确定它们的浓度。

通过采用已知浓度的分子并用紫外线照射它并测量特定波长吸收和反射光的强度，可以设置基线以允许使用比尔-朗伯定律计算该分子的任何浓度：A = εbc


其中 A 是检测器在特定波长测量的吸光度，ε是分子的摩尔吸光度，b 是通过样品的路径长度，c 是样品的浓度。


结合高效液相色谱仪和紫外光谱仪可以分离分子混合物，并通过计算从高效液相色谱仪柱洗脱后的浓度来确定它们的相对比例。