高效液相色谱基本上是柱色谱的高度改进形式。不是让溶剂在重力作用下通过色谱柱滴落，而是在高达 400 个大气压的高压下强制通过。这使它更快。它还允许您为色谱柱填充材料使用非常小的粒径，从而为固定相和流过它的分子之间的相互作用提供更大的表面积。这允许更好地分离混合物的组分。对柱色谱的另一个主要改进涉及可以使用的检测方法。这些方法高度自动化且极其灵敏。


色谱柱和溶剂

令人困惑的是，根据溶剂和固定相的相对极性，HPLC 中使用了两种变体。


正相高效液相色谱

这与您在薄层色谱或柱色谱中已经阅读过的内容基本相同。尽管它被描述为“正常”，但它并不是最常用的 HPLC 形式。色谱柱填充有微小的硅胶颗粒，溶剂是非极性的——例如己烷。典型的色谱柱内径为 4.6 毫米（可能更小），长度为 150 至 250 毫米。通过色谱柱的混合物中的极性化合物比非极性化合物在极性硅胶上的粘附时间更长。因此，非极性物质会更快地通过色谱柱。


反相高效液相色谱

在这种情况下，色谱柱尺寸相同，但硅胶通过将长烃链连接到其表面（通常具有 8 或 18 个碳原子）进行改性以使其非极性。使用极性溶剂 - 例如，水和醇（如甲醇）的混合物。在这种情况下，极性溶剂和通过柱子的混合物中的极性分子之间会产生强烈的吸引力。附着在硅胶（固定相）上的烃链和溶液中的极性分子之间不会有太大的吸引力。因此，混合物中的极性分子将花费大部分时间与溶剂一起移动。由于范德华分散力，混合物中的非极性化合物将倾向于与烃基形成吸引力。例如，由于当它们挤在水或甲醇分子之间时需要破坏氢键，因此它们在溶剂中的溶解度也会降低。因此，它们在溶剂中的溶液中花费的时间更少，这将减慢它们通过色谱柱的速度。


这意味着现在极性分子将更快地通过色谱柱。

反相高效液相色谱仪是最常用的高效液相色谱仪形式。



进样

样品的注入是完全自动化的，在这个介绍级别，您不会知道这是如何完成的。由于所涉及的压力，它与气相色谱法不同（如果您已经研究过）。


保留时间

特定化合物通过色谱柱到达检测器所需的时间称为保留时间。该时间是从样品注入时间到显示屏显示该化合物最大峰高的时间点。不同的化合物具有不同的保留时间。对于特定化合物，保留时间会因以下因素而异：


使用的压力（因为它会影响溶剂的流速）
固定相的性质（不仅是由什么材料制成，还有粒径）
溶剂的确切成分
柱温
这意味着如果您使用保留时间作为识别化合物的方法，则必须仔细控制条件。


探测器

有几种方法可以检测物质何时通过色谱柱。一种易于解释的常用方法使用紫外线吸收。
许多有机化合物会吸收各种波长的紫外线。如果有一束紫外光穿过从柱子出来的液体流，并且在液体流的另一侧有一个紫外检测器，您可以直接读取吸收了多少光。
吸收的光量取决于当时通过光束的特定化合物的量。
您可能想知道为什么使用的溶剂不吸收紫外线。他们是这样！但是不同的化合物在紫外光谱的不同部分吸收最强。
例如，甲醇在 205 nm 以下的波长处吸收，而水在 190 nm 以下处吸收。如果您使用甲醇-水混合物作为溶剂，则必须使用大于 205 nm 的波长以避免溶剂读数错误。


解释检测器的输出

输出将记录为一系列峰 - 每个峰代表混合物中通过检测器并吸收紫外线的化合物。只要您小心控制色谱柱上的条件，您就可以使用保留时间来帮助识别存在的化合物——当然，前提是您（或其他人）已经对各种不同的纯样品进行了测量。相同条件下的化合物。

但你也可以使用峰作为测量存在的化合物数量的一种方式。假设您对特定化合物 X 感兴趣。

如果您将含有已知量纯 X 的溶液注入机器，您不仅可以记录其保留时间，还可以将 X 的量与形成的峰联系起来。峰下面积与通过检测器的 X 量成正比，该面积可以由连接到显示器的计算机自动计算。它要测量的区域在（非常简化的）图中以绿色显示。


将高效液相色谱仪耦合到质谱仪

这就是它变得非常聪明的地方！当检测器显示峰时，此时通过检测器的一些物质可以转移到质谱仪。在那里它将给出一个碎片模式，可以与已知模式的计算机数据库进行比较。这意味着无需知道保留时间就可以找到大量化合物的特性。