离子色谱仪是根据离子与固定相和流动相的相互作用来分离离子的仪器。这些相在吸引阴离子的阴离子柱和吸引阳离子的阳离子柱之间是不同的。每个色谱柱只能测量它所吸引的特定类型离子的电导率。离子会根据对特定树脂的亲和力，以不同的速度通过离子色谱仪的色谱柱，根据离子电荷和大小的不同，相互分离。洗脱液通过色谱柱时，对树脂亲和力较弱的离子会较快通过色谱柱，首先被洗脱，而对色谱柱亲和力较强的离子会较慢通过色谱柱。


　　离开色谱柱后，离子被电导检测器测量。检测器将生成色谱图，并绘制电导率和时间之间的关系。每个离子在图上产生一个峰，其高度取决于注入溶液中的相对离子浓度。这些测量可用于确定未知样品中分析物的浓度。为了消除流动相中离子可能造成的干扰，可以在电导率测量前使用抑制器去除不必要的电解质。当溶液通过抑制器时，洗脱液中的离子被非离子物质取代。


　　影响分离的参数包括：

　　色谱柱——因为高分子树脂的孔隙率和大小会影响分离度，所以要选择合适的色谱柱才能达到良好的分离。较小的粒径可以提高分辨率，但会增加系统的背压。例如，填充有大尺寸珠子的柱用于蛋白质纯化的早期阶段，而较小的珠子用于流速较慢的最终纯化。


　　缓冲液——用作阳离子交换色谱流动相的典型缓冲液包括甲酸盐(3.8)、乙酸盐(4.6)、MES  (6.1)、磷酸盐(7.2)或tris  (8.1)，而用作阴离子交换色谱流动相的缓冲液包括tris、哌嗪(9.7)和二乙胺(11)。为IEX选择缓冲液时，请记住pka值(在括号中提供)。为了保持所需的pH值，缓冲溶液的浓度通常应在2050mm的范围内


　　缓冲液pH-对于阳离子交换色谱，洗脱缓冲液的pH保持在4-7的范围内，对于阴离子交换，pH保持在7-11的范围内。所选的pH值必须支持目标分析物与固定相的结合，并且应接近其pI值，以便其可以从色谱柱中释放出来。在非常低或非常高的pH值下，分析物，尤其是蛋白质，可能会牢固地结合到固定相上，这需要高盐浓度来洗脱。此外，一些蛋白质可能在高pH值和高盐浓度下沉淀或失去活性。对于阴离子交换和阳离子交换色谱，起始缓冲液的pH值应分别高于或低于目标分析物的pI  0.5至1 pH单位。必须仔细优化起始缓冲液的浓度，以确保有效分离。离子强度/盐浓度-通常用含有高达300至500 mM盐(如氯化钠、氯化钾、溴化钠、硫酸钠或乙酸钠)的缓冲液进行洗脱。


　　添加剂——如有必要，可添加尿素、糖或去污剂等添加剂，以增加分析物的溶解度，防止其沉淀或通过抑制酶活性来确保分析物的稳定性。然而，添加剂可能在工作pH值下带电，从而干扰分离。


　　样品制备-由于缓冲液的pH值决定了分子的电离状态，因此样品缓冲液的pH值保持在高于或低于目标分析物pI值0.5至1.5个pH单位。这确保了分子对于阴离子交换或阳离子交换色谱是适当带电的。虽然缓冲液的选择取决于样品基质，但起始缓冲液最适合样品制备。如果使用不同的缓冲液，可以在分析前将其与起始缓冲液交换。高离子强度溶液中的样品可以在装载前用起始缓冲液稀释，只要它不含污染物，如洗涤剂。粘性样品难以取样和分离；这些必须用起始缓冲液稀释。除pH值外，样品缓冲液的离子强度对获得良好的分离度也起着重要作用。因此，有必要对样品进行脱盐处理，并用起始缓冲液替换其缓冲液。在将样品装入色谱柱之前，必须过滤样品以去除颗粒。


　　上样-为了获得最佳分离度，分析物的质量不应超过制造商推荐的色谱柱的结合能力。

　　梯度必须优化运行时间和离子强度随时间变化的百分比，以达到所需的分离度。一般来说，阶梯式pH梯度优于线性pH梯度，因为后者难以精确和重复地产生。

　　——分辨率不受影响的最高流速可用于提高通量。在色谱柱再生和再平衡过程中，可以使用更高的流速以节省时间。

　　虽然IEX有几个优点，但它也有一些局限性(表2)，在选择该技术进行生物分子的分离、纯化或定量时必须考虑这些因素。