离子交换色谱法

　　纯化蛋白质和其他带电分子最常用的方法是离子交换色谱法。在阳离子交换色谱中，带正电荷的分子被带负电荷的固体支持物所吸引。相反，在阴离子交换色谱中，带负电的分子被带正电的固体支持物吸引。


　　机制

　　为了优化所有带电分子的组合，流动相通常是具有低至中等电导率(即低至中等盐浓度)的溶液。分子在固体载体上的吸附是由样品分子中带相反电荷的离子基团和载体上的功能配体之间的离子相互作用驱动的。相互作用的强度取决于分子和官能团上电荷的数量和位置。通过增加盐浓度(通沙巴滚球官网入口过使用线性盐梯度)，具有最弱离子相互作用的分子首先开始从色谱柱中洗脱。具有更强离子相互作用的分子需要更高的盐浓度，并在梯度中更晚洗脱。离子交换树脂的结合能力通常很高。


　　缓冲液pH值

　　通常，流动相缓冲液的pH值必须在带电分子的pI(等电点)或pKa(酸离解常数)和固体载体上带电基团的pKa之间。例如，在阳离子交换色谱中，使用pKa为1.2的固体载体上的官能团，pI为8.2的样品分子可以在pH为6.0的流动相缓冲液中运行。在阴离子交换层析中，当固相支持物的pKa为10.3时，pI为6.8的分子可以在pH为8.0的流动相缓冲液中运行。


　　盐梯度

　　与大多数其他色谱模式(SEC除外)一样，蛋白质样品在强保留条件下被注入色谱柱。然后应用线性增加的盐浓度梯度从柱中洗脱样品成分。另一种使用线性渐变的方法是使用梯形渐变。这需要不太复杂的设备。如果适当的盐浓度是已知的(通常来自线性梯度实验)，不同的级分可以被非常有效地洗脱。


　　不同的pH值

　　许多色谱工作者也利用pH值的变化来影响分离。在阳离子交换色谱中，提高流动相缓冲液的pH值会降低分子的质子化程度，因此正电荷的程度也会降低。结果，蛋白质不再能与带负电荷的固体支持物形成离子相互作用，最终导致分子从柱上洗脱。在阴离子交换色谱中，降低流动相缓冲液的pH值会使分子变得更加质子化，从而携带更多的正电荷(和更少的负电荷)。结果，蛋白质不再能与带正电荷的固体支持物形成离子相互作用，这导致分子从柱中洗脱。