高效液相色谱是分析离子、蛋白质和有机分子的一种强有力的分离技术。高效液相色谱基于吸附、分配和离子交换机制，具体取决于所用固定相的类型。该技术包括固体固定相和液体流动相，它们通常封装在不锈钢柱中。感兴趣的分子根据两相之间溶质相对分配比的差异而被分离。高效液相色谱法被广泛用于评估纯度和确定潜在药物分子的含量。它也可用于测定对映体组成，使用改良的流动相或手性固定相。


　　原则


　　高效液相色谱的工作原理是样品的某些成分通过色谱柱的时间比其他成分长。分子花费的时间取决于分子与流动相(液体或气体)和固定相(固体或液体)的亲和力。那些与固定相有更大亲和力的物质需要更长时间才能通过色谱柱，反之亦然。


　　工具


　　该装置由泵送系统、进样阀、色谱柱、固定相和流动相、连接管、检测器和数据采集装置组成。该泵用于确保以1.0毫升/分钟的速度向分析柱提供可调、恒定和可再现的流速。注射器将可变且可再现的样品体积的窄流引入分析柱的顶部。分析柱中分析物的最佳水平保持在可接受的压降。该检测器为系统检测色谱柱信号提供了高灵敏度、线性度和长期稳定性。数据采集设备采集和存储数据并进行计算。这些计算用于控制和调整操作参数和分离条件。


　　草案


　　流动相的制备


　　将400毫升乙腈加入约1.5升纯去离子水中。


　　向该溶液中加入冰醋酸(2.4毫升)。


　　用纯化的去离子水稀释溶液，使容量瓶中的总体积为2.0 L。所得溶液的酸碱度应在2.8至3.2之间。


　　加入40%氢氧化钠，调节pH值至4.2。


　　真空过滤流动相，去除溶液中可能堵塞色谱柱的气体和固体。


　　组分溶液制备


　　根据待分离组分的要求制备样品溶液。


　　开发标准解决方案


　　在一个50毫升的容量瓶中取适量的每种成分。


　　用流动相将储备溶液稀释至容量瓶上的50毫升标记。


　　将每个标准溶液倒入小瓶中。


　　将样品和剩余溶液一起储存在冰箱中。


　　检查高效液相色谱系统的设置


　　确保废物管线位于废物容器中。


　　将流动相的流速设置为0.5毫升/分钟。


　　将最小和最大压力和流量设置为输送泵前面板上的正确值。


　　将最小压力设置为250磅/平方英寸。


　　将最大压力设置为4，000磅/平方英寸。


　　按下检测器前面板上的“零”，将其设置为纯流动相。用去离子水冲洗100l注射器，然后用几倍体积的待分析成分溶液冲洗，然后填充注射器。


　　取样和数据收集


　　通过隔膜口在装载位置缓慢注射100微升溶液和注射器手柄。


　　设置数据采集程序，采集数据300秒，通过检测器得到三个要洗脱的峰。


　　开始测试前，将注射器手柄转到注射位置，立即点击计算机数据采集程序上的“开始测试”。


　　300秒后，数据采集器会发出保存数据文件的信号。


　　记录每次测试的峰值时间(以秒为单位)，以识别每个组件。


　　从隔膜中取出注射器，并对每个剩余的工作标准执行该过程。


　　计算


　　计算样品溶液中所有成分的浓度。


　　每个标准样品和未知样品的色谱峰面积通过三角测量确定，等于峰高乘以高度处的宽度


　　确定组件达到峰值所需的时间。


　　绘制所有组分的峰面积和浓度(毫克/升)的校准曲线。


　　计算校准曲线的最小二乘拟合。


　　优点和局限性


　　与其他色谱技术相比，高效液相色谱非常快速和高效。


　　该过程平均需要10到30分钟，并提供高分辨率。它是一种高度精确和可重复的有机分子分离技术。


　　高效液相色谱只需要最低限度的培训，包括自动化设备。


　　高效液相色谱是一种通用且极其精确的分析方法，用于识别和定量化学成分。


　　高效液相色谱的优点包括需要小样本量，根据所需的定量水平进行修改，以及结果的可靠性。


　　尽管它有优点，但它可能很贵，需要大量昂贵的有机物。