液相色谱是一种成熟的物质分离技术。高效液相色谱是一种适用于广泛应用的分析方法。在这里，我们描述了高效液相色谱的原理，并介绍了高效液相色谱系统最重要的组成部分和决定测量成功的因素。


　　高效液相色谱原理

　　高效液相色谱的分离原理是基于分析物(样品)在流动相(洗脱液)和固定相(色谱柱填料)之间的分布。根据分析物的化学结构，分子在通过固定相时会发生延迟。样品和填充材料之间特定的分子间相互作用决定了它们的“加载时间”。因此，样品的不同成分在不同的时间洗脱。从而实现样品成分的分离。

　　检测单元，例如紫外检测器，在离开色谱柱后识别分析物。信号由数据管理系统(计算机软件)转换和记录，然后显示在色谱图中。在通过检测器单元后，流动相可以经受额外的检测器单元、馏分收集单元或废物处理。通常，高效液相色谱系统包括以下模块：溶剂容器、泵、进样阀、色谱柱、检测器单元和数据处理单元(图1)。溶剂(洗脱液)以高压和恒速泵送通过系统。为了尽可能减少探测器信号的漂移和噪声，泵的恒定无脉冲流量非常重要。分析物(样品)通过进样阀提供给洗脱液。


　　梯度与等度

　　根据流动相的组成，通常有两种不同的模式。如果流动相的组成在分离过程中保持不变，高效液相色谱系统被定义为等度洗脱系统。当流动相组成在分离过程中发生变化时，高效液相色谱系统被定义为梯度洗脱系统。对于梯度系统，可以使用两种不同的技术：低压梯度(LPG)和高压梯度(HPG)。低压梯度意味着溶剂的混合发生在泵的上游(吸入侧)。在高压梯度系统中，不同的溶剂由单独的泵供应，并在泵后混合(排出侧)。[1]图2示出了LPG和HPG梯度模式的示例性系统配置。


　　柱子

　　该色谱柱代表任何高效液相色谱系统的核心。它负责样品成分的完全分离。分离沙巴滚球官网入口与柱内径、柱长、柱填料类型和粒径有关。根据所需的应用，市场上有多种高效液相色谱柱。不同的填料支持不同的分离机制。——常用材料用于正相、反相、尺寸排阻、离子交换、亲和、手性或亲水相互作用HPLC。


　    探测器

　　检测器单元的任务是记录从色谱柱上洗脱的物质的时间和数量。检测器检测洗脱液成分的变化，将该信息转换成电信号，并在计算机的帮助下对其进行评估。根据分析物的结构特征，可以使用多种检测器。常见的检测器单元有折射、紫外/可见、电化学和荧光检测器。图4示出了具有不同检测器的两种等度系统配置。

        色谱参数

　　检测器单元将流动相输送的分离分析物记录为信号峰。所有峰的总量称为色谱图。每个单独的峰提供分析物的定性和定量信息。定性信息由峰本身给出(例如形状、信号强度、色谱中的时间)。此外，峰面积与物质的浓度成正比。因此，色谱数据管理软件可以通过集成计算样品浓度。这提供了定量信息。理想情况下，峰值记录为高斯钟形曲线。图5示出了示意性示例。


　　延迟时间(t0)

　　延迟时间是指将未延迟的化合物从注射点转移到检测器单元(记录化合物的位置)所需的时间。在此期间，所有样品分子仅位于流动相中。通常，所有样品分子共享相同的延迟时间。分离是由于物质和固定相之间的粘附力不同造成的。


　　保留时间(tR)

　　保留时间是指化合物从注射到检测所需的时间。因此，它代表分析物处于流动相和固定相的时间。保留时间因物质而异，应始终在相同条件下提供相同的值。


　　峰值宽度(w)

　　峰值宽度涵盖了检测器信号反复下降后从信号斜率开始到基线的时间段。

　　拖尾因子(t)

　　事实上，完全对称的峰非常罕见。在色谱图中，它们通常显示一定程度的拖尾。峰值拖尾通过拖尾因子T来测量.这个因子描述了峰的不对称性，即形状接近完美对称高斯曲线的程度。拖尾因子的测量如下：T=b/aa代表峰的前半部分的宽度，b是峰的后半部分的宽度。这些值是在峰高的10%处测量的，从峰的前缘或后缘到从峰点垂直下降的直线(见图5)。[4] T=1代表对称峰。为了t1、峰值轮廓称为拖尾。对于T  1，峰值轮廓称为前沿。