高效液相色谱是一种分析化学技术，用于分离、鉴定和定量混合物中的每种成分。它依靠泵使含有样品混合物的加压液体溶剂通过装有固体吸附材料的色谱柱。样品中各组分与吸附材料的相互作用略有不同，导致流速不同，从而导致组分在离开色谱柱时发生分离。高效液相色谱法已被用于制造(药物和生物制品的生产过程)、法律(检测尿液中的增强性能药物)、研究(分离复杂生物样品或合成化学品的成分)和医疗(检测血清中的维生素D水平)。高效液相色谱法最初是为了分析光合微生物(包括蓝藻和藻类)分泌的有机酸而开发的，但也可以用于分析任何在液体培养基中培养的微生物分泌的有机酸。


　　A.试剂和制备


　　试剂


　　蓝细菌，聚球藻属。


　　液体培养(蓝细菌或其他微生物)


　　8 mM  H2SO4:将0.898 ml  H2SO4 (98%)溶解在1000 ml  dH2O中。使用0.45米过滤装置进行过滤。


　　50 mM琥珀酸酯原液：将14.76 mg琥珀酸酯溶于25 ml  dH2O中。储存在-20摄氏度。


　　50 mM  -酮戊二酸原液：将18.26 mg  -酮戊二酸溶于25 ml  dH2O中。储存在-20摄氏度。


　　50 mM醋酸原液：将71.4l醋酸溶解在25 ml  dH2O中。储存在-20摄氏度。


　　50 mM丙酮酸盐储备溶液：将88.65l丙酮酸盐(98%)溶解在25 ml  dH2O中。储存在-20摄氏度。


　　50mm-酮异己酸酯原液：154.19 l-酮异己酸酯(


　　98%)溶解在25毫升dH2O中。储存在-20摄氏度。


　　10 mM有机酸标准混合物：将2 ml上述五种50 mM有机酸标准混合，得到10 mM混合有机酸溶液(最终体积10 ml)。将混合有机酸溶液串联稀释以产生适于构建标准曲线的浓度范围；例如，5 mM、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.25 mM、0.1 mM.标准曲线的浓度范围应涵盖在细胞外样品中测量的浓度范围。储存在-20摄氏度。


　　装备


　　微型离心机


　　Surveyor  Plus  HPLC包括Surveyor  LC泵、Surveyor自动进样器、Surveyor光电二极管阵列(PDA) Plus检测器和Surveyor折射率(RI) Plus检测器Aminex发酵监测柱(150mm7.8mm)，固定相聚苯乙烯-二乙烯基苯磺酸树脂，9微米粒度，8%交联


　　微保护阳离子氢滤筒保护柱，30 x  4.6毫米，氢型，酸碱度范围1-3，用于Aminex氢型柱


　　Chromquest软件和chromquest软件平台


　　样品制备


　　使用移液管，从液体培养物中取出2 ml等分试样，置于2 ml  Eppendorf管中，并以13，000 xg离心10分钟以沉淀细胞。


　　上清液是含有分泌的有机酸的细胞外介质，被除去并保留。此时，上清液可在-20下冷冻，用于随后的高效液相色谱分析，或如以下步骤所述立即分析。


　　使用1毫升一次性注射器和孔径为0.45米的过滤器，将500-700升样品上清液过滤到色谱瓶中，以去除可能干扰有机酸检测的颗粒，并堵塞数值和线路。对用于构建标准曲线的每个有机酸标准样品重复上述步骤。关上药瓶。这些现已准备好进行高效液相色谱分析。


　　B.程序


　　8毫摩尔H  2 SO  4用作等度洗脱的流动相。


　　使用Chromquest软件将色谱柱温度升至35，然后升至45(使用0.1毫升分钟-1的流动相流速)。将折射率检测器设置为50.


　　色谱柱达到45后，下载具有以下设置的样品测量方法。这些设置是发酵监测柱的标准方案，唯一的优化是增加运行时间，以确保样品完全从柱中洗脱出来。


　　等待10分钟使基线稳定，将样品瓶放入自动进样器托盘，为您的操作创建一个新的序列文件，自动将PDA  Plus和RI检测器归零，然后开始操作。


　　步骤3中的设置


　　研究者LC泵：总流量，0.5毫升/分钟；压力极限，0-1100磅/平方英寸；运行时间，40分钟。


　　测量员PDA  Plus:运行时间，40分钟；扫描，200-360 nm，扫描速率，1.0hz带宽1纳米。


　　测量员：注入量，25升；从针到底部的高度，2.0毫米；注射器速度，8 l秒-1；冲洗速度，70升秒-1；冲洗量，500升；洗涤量，300升；冲洗/洗涤源，8 mM  H2SO4流动相；将托盘温度设置为10；让烤箱控制的温度达到45.测量员RI  Plus:运行时间，40分钟；数据速率，10hz；温度控制设置为50.


　　数据分析


　　PDA  Plus检测器和RI检测器产生的典型色谱图如下所示。


　　Chromquest软件用于整合和量化每个有机酸峰下的面积。


　　通过绘制峰面积和已知浓度之间的关系，为每种有机酸创建了标准曲线。


　　使用标准曲线计算上清液样品中每种有机酸的浓度。这将给出细胞外介质中有机酸的浓度。数据可以标准化为细胞计数，以确定每个细胞分泌的有机酸量。